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狂牛的復仇

Universiry of Oxford, Medical Sciences Division
Department of Physiology

張偉嶠

曾經重創歐洲畜產業的狂牛病又來了, 但這次的新病例出現在美國, 因此美國牛肉到底該不該進口的問題在台灣引起廣泛的討論。在本文中, 我們將對狂牛病的起源、相關的研究歷史背景進行介紹, 讓讀者對於這神秘的疾病有更進一步的瞭解。



在二十多年前,美國科學家Stanley B. Prusiner教授1997年諾貝爾獎醫學生理學獎得主)提出::變異變性的蛋白質可能於動物界甚至人群間傳播,進而造成中樞神經系統退化等疾病的發生。在當時,許多科學家們都抱持著高度懷疑的態度,因為缺乏DNARNA等遺傳物質的分子如何能在宿主體內複製存活呢?又如何能建立感染路徑? 舉例來說:病毒,這個構造最簡單的微生物也是需要依賴DNARNA來進行複製,才能感染宿主。

然而,在Stanley B. Prusiner教授所提出的理論中,他卻認為那些異常的prions蛋白可以「影響帶壞」其他正常的prions蛋白,造成其構型上的改變。這些異常prions蛋白的持續堆積在腦中會造成腦組織出現海綿狀空洞,進而影響正常的中樞神經系統功能。換句話說,prion這個病原有別於細菌、黴菌、病毒等微生物,它對紫外線及消毒劑有很強的抵抗力。它不具有遺傳物質(例如DNARNA)卻可以在宿主身上造成疾病。它是一種蛋白質,但高溫卻破壞不了它,這個神秘的病原大大地顛覆了傳統的思維,然而越來越多的證據顯示這個可怕的病原確實存在。

左圖為1997年諾貝爾獎醫學生理學獎得主Stanley B. Prusiner教授。((圖片載從The Nobel Foundation 右圖則為prion在腦組織中造成的海綿樣腦病變。(圖片載從BBC News

一些可能由prions所造成的疾病又常被稱為海綿樣腦病變spongiform encephalopathies),因為這些病態的腦組織往往嚴重受到傷害,神經細胞大量死亡,且呈現類似海綿狀,腦組織中散佈著許多小空洞... 。事實上,這潛伏期長達數年的神秘疾病在動物界卻是相當常見的,其中最有名的例子便是羊搔癢症Scrapie)。早在1732年,人們就已經發現一種發生於綿羊身上得神經退化性疾病。這些生病的羊隻會有行動不穩、無法站立、顫抖、因劇烈的搔癢而造成羊隻磨蹭樹幹以至於刮去scrape off)身上的毛 Scrapie的命名由來) ,、最終導致羊隻死亡。至於prions於牛隻身上所造成的牛海綿樣腦病Bovine spongiform encephalopathy,, 簡稱: BSE),就是我們所熟悉且憂心忡忡的狂牛病mad cow disease) 。

左圖為無法站立的狂牛病病牛 (圖片載從CNN news)。右圖則為患有羊搔癢症病羊,其身上的毛因劇烈搔癢而磨蹭刮去(圖片載從Journal of American Veterinary Medical Association

狂牛病曾在歐洲掀起恐慌,其中又以英國的疫情最為嚴重,所以即使至今,相較於其他肉類,牛肉在英國超市中仍是較為乏人問津,英國民眾似乎對於狂牛病仍有著揮之不去的陰霾…。不過,為什麼原本只在羊隻身上發生的羊搔癢症也會出現在牛隻身上呢? 英國中央獸醫研究所實驗室Central Veterinary Laboratory)的John W. Wilesmith等人發現:飼養牛隻的飼料上出了問題因為使用了病死羊肉的製品(尤其是骨粉、脊髓、內臟等等),餵食牛群而造成prions蛋白從羊群中跨過了物種族藩籬感染了牛群。

從過去的歷史中,科學家曾經在巴布亞新幾內亞Papua New Guinea)的食人族聚落中發現了一種神秘且可怕的疾病,當地人稱此即疾病為: 枯魯Kuru)。這個可怕的疾病造成部落中許多婦女與小孩出現運動功能失調、傻笑、癡呆等病徵,然後悲慘地死亡。當時,部分科學家們認為這是一種家族性遺傳疾病,直到1957年,Vincent Zigas醫師 與 Carleton Gajdusek醫師發現死者的腦部組織壞損嚴重且呈現海綿狀空洞,他們也注意到該聚落土著中婦女與小孩食用死者腦部的怪異習性(男人只吃肌肉部位),因此高度懷疑可能是存在於死者腦中的病毒經由飲食散佈開來。當該部落的食人肉儀式被禁止後,枯魯症也就不在發生了,如今,科學家們已經知道枯魯kuru症的罪魁禍首也是prions





左圖為巴布新幾內亞罹患枯魯症的病童(圖片載從Linda Zambenini,Indiana University,USA))。右圖為1976年諾貝爾獎醫學生理學獎得主Carleton Gajdusek醫師((圖片載從The Nobel Foundation)

至於庫雅氏症(Creutzfeldt-Jakob disease,,簡稱CJD)也被認為是一種發生於人類且與prions病原息息相關的疾病,其病徵與枯魯症相似,但不若枯魯症的地區侷限性,庫雅氏症偶發於全球各地,大多為六十歲以上患者,發生機率僅僅約百萬分之一。 除了少數是由遺傳變異所造成之外,不幸地,大多數案例為不當的醫療手術所造成,如眼角膜移植、腦部外科手術污染等等。

其實最令大家擔心害怕的是1996年出現於英國的新型變種庫雅氏症New variant Creutzfeldt-Jakob disease,,簡稱vCJD)。雖然vCJDCJD兩者所造成的腦部病徵相似,但CJD多發生於老年人,而vCJD則好發生於二十多歲的年輕人,且具有相當高的致死率。吃到狂牛症病牛則是感染vCJD的最可能原因,尤其病牛的腦部、脊髓、淋巴結等部位都含有高量的致病性prion蛋白,所以被認為是最危險的部位。遺憾的是科學家們對於這個疾病所知相當有限,不僅早期診斷技術非常缺乏,更別談對付狂牛病的藥物研發。英國政府曾經大規模地焚燒銷毀病牛,但即使病牛死後的骨灰仍可以發現prions的蹤跡,由此也可知這個變異蛋白是有多麼難纏

左圖為在英國境內帶有狂牛病的牛隻之年度統計數字。右圖則是巴布新幾內亞罹患枯魯症病人之年度統計數字。(圖片載從Science, Vol. 278, pages 246

在研究狂牛病這個領域上已經產生兩位諾貝爾獎醫學暨生理學獎得主19761997)。第一位是Carleton Gajdusek醫師,他於巴布亞新幾內亞的食人族部落發現枯魯kuru)症,並推測病源可能是一種慢性作用病毒slow-acting virus)。Stanley Prusiner教授則是第二位研究該領域獲獎的科學家,他發現造成羊搔癢症的病原並不是病毒,它是一種不含DNARNA的物質,事實上,它只是一種變異的蛋白質,Prusiner教授並將此具感染力病原命名為Prion proteinaceous infectious particles)。

在研究這領域的早期,Carleton Gajdusek醫師推測病原為慢性作用的病毒,不過當時有一篇來自英國倫敦Hammersmith醫院的研究報告卻深深吸引著Prusiner教授, 在那篇文章中,Tikvan Alper等人將患有羊搔癢症的病羊腦部組織經過紫外光或離子射線處理後,卻發現這些組織仍然具有感染能力...這是非常奇怪的,因為經過紫外光或離子射線處理後,核酸物質nucleic acid)是會被摧毀的,所以所有具感染力的病原都應該被消滅。除非感染原根本不是一般所熟悉的細菌或病毒,除非感染原根本不具有DNARNA…因為這篇報告,Prusiner教授決心純化出造成羊搔癢症的這個神秘病原。

1974年,Prusiner教授在美國加州大學舊金山分校UCSF)開始進行他的研究。在研究的初期,他們希望從羊搔癢症的綿羊腦部組織中提煉出傳染病原,這是一項困難且危險的任務,Prusiner教授實驗室中的許多研究人員對於這項工作感到深深的挫折感,但他再三的堅持下,這項純化傳染病原的工作總算完成。

1982年, Prusiner教授於美國《科學》期刊上發表了一篇名為 『〈一個造成羊搔癢症的新穎傳染性蛋白質〉』Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216:136 (1982))的研究論文,文中提到了prion這個新名詞(發音為 pree on),它有別於我們所知道的其他病原。至於這個病原體中最主要的致病性蛋白質又被稱為prion蛋白,簡稱PrP prion protein)。文中也提到了Prion蛋白的大小約50 kD,在攝氏90高溫中或紫外線照射下254 nm)仍相當安定,不會被核醣核酸酵素ribonuclease) 、去氧核醣核酸水解酵素(deoxyribonuclease)所分解。那重要的問題出現了,蛋白質是經由基因經過轉錄轉譯而來,PrP基因又在哪裡

Prusiner教授經由與加州理工學院Leroy E. Hood等人的合作,他們定出PrP一端的其中十五個胺基酸序列,然後利用這段序列反推核酸序列並製作成分子探針molecular probes)。有了這個探針,他們就可以進一步的探討哺乳動物細胞中是否帶有PrP基因。不久,瑞士科學家Charles Weissmann發現倉鼠細胞hamster cells)中帶有PrP基因, 幾乎在同一時間,美國科學家Bruce Cheseboro也在小鼠mouse)中發現PrP基因,接著許多哺乳類動物的細胞都被檢測,令人訝異的是許多哺乳類動物都帶有PrP基因,人類也不例外!!那為什麼這些帶有PrP基因的動物都沒有得到疾病呢?這個問題曾經讓當時的Prusiner研究團隊陷入困境,甚至懷疑PrP根本與疾病無關。



全長245個胺基酸的人類PrP蛋白質結構特徵(圖片載從Jean C. Manson and Nadia L. TuziExpert Reviews in Molecular Medicine

Prusiner教授進而大膽的推測細胞內可能有兩種不同的PrP,一種是會致病的,一種卻是正常的。這個假設讓他有如中了樂透獎般,因為他找到了PrP致病與否的關鍵因素。原來,一般蛋白質是很容易被細胞內一種名為Protease的酵素所分解,不過Prusiner研究團隊卻觀察到:從感染的腦部組織中萃取出來的PrP是相當不容易被分解破壞的,這種奇特的性質與正常蛋白質非常不同,所以他進一步把這個會造成羊搔癢症Scrapie)且不易被分解的PrP命名為PrPsc Scrapie PrP),與正常且易被分解的PrPc cellular PrP)已示區別。

要證明PrP就是致病關鍵的最重要證據就是能在小鼠腦內誘導發病。 Prusiner研究團隊在這方面的研究一直不太順利,所以他們將研究心力轉移到分析具有家族遺傳性Prion疾病Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome)的病人PrP基因序列。結果發現:病人的PrP基因序列中有一個位置出現突變這樣的發現也暗示著產生突變的PrP是危險的。 接著,他們回到小鼠身上進行實驗,利用轉基因技術改變小鼠的基因,讓小鼠帶有突變的PrP基因,這些突變的PrP基因會轉譯出許多突變的PrP蛋白質。如果突變的PrP與致病有關,那這些轉殖小鼠應該是會發病的,實驗結果與他們的預期相同--──小鼠發病了,這項發現可謂是他們研究初期的一大進展。

既然PrPscScrapie PrP)是致病的、不易被破壞的;PrPccellular PrP)是正常且易被分解的。那PrPscPrPc在蛋白質結構上又有什麼差異呢?經過分子模擬分析,Prusiner的研究團隊發現PrPc(正常的蛋白質)是由alpha helices所組成,至於PrPsc(致病的蛋白質)則是完全不同的Beta-Sheet構造。蛋白質結構上的差異也造成了兩者完全不同的化學性質,相較於PrPc Beta-Sheet結構的PrPsc更為穩定,更不易被酵素所分解。此外,他們也認為PrPsc可以誘導腦中正常alpha helices構型的PrPc轉變成Beta-Sheet構型的PrPsc,但誘發機制方面的相關研究仍是相當模糊。





左邊為正常的PrP蛋白質三級結構, 右邊則是呈現Beta-Sheet構型的致病性PrPsc蛋白質結構(圖片載從Linda Zambenini,Indiana University,USA)。

回到最初的發現,羊搔癢症是一種發生於綿羊身上的神經退化性疾病。在英國,因為餵食牛群的飼料出了問題而導致prions蛋白從羊群中跨過了藩籬感染了牛群。人類吃了生病的牛,於是prions又跨過了人與牛間的物種族屏障species barrier)感染了人類。其實早在1960年代,英國科學家Pattsion就已經發現:羊搔癢症是很難從羊隻身上傳染到齧齒類動物的。然而,Prusiner教授的研究團隊利用轉基因技術讓小鼠帶有倉鼠PrP基因後,他們發現物種族屏障是可以被打破的。因為感染倉鼠的prion病原是不會感染正常小鼠,但插入倉鼠PrP基因後的小鼠(同時帶有小鼠與倉鼠之PrP基因)就會被倉鼠prion病原感染發病。

Prusiner的研究團隊也進一步發現:種族屏障的出現與各種系間的PrP胺基酸序列差異有關。也就是說Scrapie PrP 分子的蛋白質序列與宿主本身PrP序列越相近者,該宿主就越容易被感染。舉例來說:小鼠的PrP序列與倉鼠有16個胺基酸不同,所以正常小鼠並不容易受到倉鼠的PrPsc感染致病。至於羊與牛的PrP序列就非常地相似了(只有7個胺基酸不同),所以造成羊搔癢症的PrPsc就很容易經由食物感染牛隻。 牛隻的PrP序列與人類則具有相當大的差異性(超過30個胺基酸不同),屏除一些特例的突變的PrP基因不說,PrPsc從牛隻跨越物種族屏障傳染給人的機率是相對較低的。

至今,PrPsc破壞細胞的機制仍是個謎?當然, 要研發治療藥物更是難上加難。雖然在細胞實驗階段,科學家們已經發現致病性的PrP會累積在溶小體lysosmes) ,最終脹破溶小體並破壞細胞而在腦部組織中留下海綿狀空洞。在某些病人腦部組織中,科學家也可以在病人組織中發現致病性PrP蛋白質片段堆積所形成的蛋白質斑塊Plaques) 。也許這些蛋白質斑塊在臨床病情是相當好的診斷標記,不過蛋白質斑塊似乎並不是造成病情惡化的主要導因,因為在某些受到Prion感染的人類或動物組織中,科學家卻未發現蛋白質斑塊。

左圖顯示在惡化的海綿樣腦病變組織周圍出現蛋白質斑塊凝集。右圖顯示這些沉積的蛋白質斑塊具有PrP免疫活性PrP-immunopositive )。(圖片載從Science,Vol. 278,pages 249

雖然不知道PrPsc是透如何種機制破壞腦組織的?但科學家們深信:如果我們能對PrPsc的蛋白質三度空間結構有更深入的瞭解,將會大大有助於治療藥物的研發上。舉例來說吧!!如果能研發出一種藥物,這種藥物可以與可以與正常的PrPc結合,安定其構型而防止PrPc轉變成致病性的PrPsc,那這就是一種相當好的治療策略了。反之,若能發現一種可以崩解致病性PrPsc結構的藥物, 這也可能會是一種有效的治療。

在動物實驗方面,瑞士科學家Charles Weissmann等人曾經將小鼠的PrP基因剔除,幸運地,小鼠的一切生理功能正常且從此PrPsc無法感染該小鼠。如果在人體中PrP基因也是那麼不重要,未來也許可以利用反義RNAantisense RNA)或RNAi等治療方式,不過這是最理想的情況,相關研究還有一段很長的路要走。

對於愛滋病、癌症…等疾病,人們有計畫地一步步地展開預防工作、開發藥物甚至疫苗,但面對Prions、新型變種庫雅氏症(vCJD)…這種怪異的危險疾病,科學家們突然間變得無知或許該說無力吧一般的高溫高壓、紫外光、消毒藥劑等滅菌方式都無法消滅的病原、具傳染力、高致死率、沒有遺傳物質卻能複製並攻擊神經細胞,這種超越傳統遺傳學概念的分子到底是什麼我也是越寫越糊塗了。

(張偉嶠于牛津大學 2005九月)

參考文獻

Scrapie Disease In Sheep. Herbert B. Parry. Edited by D. R. Oppenheimer. Academic Press, 1983.

Molecular Biology Of Prion Diseases. S. B. Prusiner in "Science," Vol. 252, pages 1515-1522; June 14, 1991.

Prion Diseases Of Humans And Animals. Edited by S. B. Prusiner, J. Collinge, J. Powell and B. Anderton. Ellis Horwood, 1992.

Fatal Familial Insomnia:: Inherited Prion Diseases, Sleep, And The Thalamus. Edited by C. Guilleminault et al. Raven Press, 1994.

Molecular Biology Of Prion Diseases. Special issue of "Philosophical Transactions of the Royal Society of London, Series B," Vol. 343, No. 1306; March 29,1994.

Structural Clues To Prion Replication. F. E. Cohen,. K.-M. Pan, Z. Huang, M. Baldwin, R. J. Fletterick and S. B. Prusiner in "Science," Vol. 264, pages 530-531; April 22, 1994.

Prion diseases and the BSE crisis. S. B. Prusiner in "Science", Vol. 278, pages 245-251;October 10, 1997.





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